*
Investigadores. Centro Naciónal de Investigaciónes Agropecuarias
(INIA-CENIAP). Unidad de Biotecnologia Agricola. Zona Universitaria, via
El Limon, Edificio 09. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela. E-mail: esalazar@inia.gob.ve
**
Investigador. INIA LARA. Carretera Barquisimeto, via Duaca, km 7.
Caserio El Cuji, entrada a Las Veritas, Barquisimeto, estado Lara.
Venezuela.
RESUMEN
El
cocuy, Agave cocui Trelease es importante para las zonas semiaridas del
centro-occidente de Venezuela. Involucra sistemas de producción
tradiciónal de licor, jabon, conservas, entre otros. Soportando
economicamente muchas familias en el estado Lara. La producción se basa
en plantas creciendo naturalmente, con suplencia de materia prima
limitada. Para aumentar la disponibilidad de plantas e incrementar la
actividad economica de estas comunidades rurales, sistemas de
propagación asexual han sido implementados, con una tasa de crecimiento
lenta y la producción de plantas no cubre la demanda. Un sistema de
propagación in vitro usando yemas axilares se ha establecido. Las yemas
se colocaron en medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con tiamina (1
mg l-1), acido nicotinico (1mg l-1), piridoxina-HCl (1 mg l-1), mio-inositol (100 mg l-1), BA (1 mg l-1), ANA (1 mg l-1) sacarosa (30 g l-1) y Agar (5g l-1).
Cuarenta explantes fueron cultivados en 10 ml del medio de cultivo, y
sembrados en la oscuridad por 7 dias. Las yemas se transfirieron a luz
fluorescente (16,95 W.m-2), 28 ± 2
ºC y fotoperiodo de 16 h. Los brotes fueron evidentes 1 mes posterior
al cultivo in vitro, y 6 brotes en promedio se observaron por yema
cultivada. La tasa de brotación aumento cuando la temperatura subio a 40
ºC. Plantas completas se obtuvieron en medio sin hormonas. El
transplante a suelo (1:1:1 de suelo:arena: aserrin de coco) permitio la
aclimatación de las plantas en 1 semana. Todas las plantas tuvieron
morfologia normal, por lo que el cultivo in vitro de yemas axilares se
puede decir es un metodo eficiente para propagar A. cocui Trelease.
Palabras Clave: Cocuy; cultivo in vitro; meristemas; yemas axilares; micropropagación.
In vitro multiplication of agave cocui trelease through axillary buds
SUMMARY
The
cocuy, Agave cocui Trelease is an important crop for the semiarid zones
of the central-west part of Venezuela. It is involved in a traditional
production systems for liquor, soap, preserves, among others. It is the
economical support of many families in Lara State, Venezuela. Normally,
the production was based in naturally occurring plants, so supply of
plants is limited. In order to increase plant supply and improve the
economical activity of these rural communities, asexual propagation
systems have been implemented with slow growth rate and plant production
not enough to satisfy the demand. A mass propagation system using
axillary buds have been established. Buds were placed on Murashige and
Skoog (MS) medium supplemented with thyamine (1mg l-1), nicotinic acid (1mg l-1), pyridoxine HCl (1mg l-1), inositol (100mg l-1), BA (1mg l-1), ANA (1mg l-1) sucrose (30 g l-1) and Agar (5g l-1).
Forty explants were cultured in 10ml of culture medium, and were placed
in the dark for 7 days. Buds were placed under fluorescent light (16.95
W.m-2), at 28 ± 2
ºC and a 16 hr photoperiod. Shoots were observed 1 months after
culture, an average of 6 shoots were observed for each cultured axillary
bud. Sprouting ratio was increased when temperatures was increased to
40 ºC. Complete plants were obtained by transferring shoots to medium
with no hormones. Transplant to soil (1:1:1 soil:sand:coconut sawdust)
allowed plants to be acclimatized in 1 week. All plants have normal
morphology. As a conclusion axillary bud in vitro culture can be
referred as an efficient method to propagate A. cocui Trelease.
Key Words: Cocuy; in vitro culture; meristems; axilarry buds; micropropagation.
RECIBIDO: febrero 06, 2008 ACEPTADO: enero 19, 2009
INTRODUCCIÓN
El
cocuy, Agave cocui Trelease, es un cultivo autóctono de Venezuela, y es
importante para las zonas semiaridas del centro-occidente de Venezuela.
Este cultivo, involucra un sistema de producción tradicional de varios
productos, tales como licor, jabon, conservas, y muchos otros usos. Es
el soporte economico de muchas familias de los estados Lara y Falcon en
Venezuela, estando presente su uso desde epocas precolombinas (Gonzalez-
Batista, 2000).
La
producción tradiciónalmente se basa en plantas creciendo naturalmente,
por lo que la suplencia de materia prima es limitada. A fin de aumentar
la disponibilidad de plantas de cocuy e incrementar la actividad
economica de estas comunidades rurales de bajos recursos, pertenecientes
a los municipios Urdaneta, Iribarren y Torres del estado Lara, algunos
sistemas de propagación asexual, tal como la siembra de bulbilos en
canteros, han sido implementados; sin embargo, la tasa de crecimiento es
lenta y la producción de plantas no es suficiente para satisfacer la
demanda, ocasionando la utilización indiscriminada de las poblaciónes
naturales, con el consecuente riesgo de perdida de la diversidad
biologica.
La
multiplicación in vitro a traves de yemas o meristemas, es una
estrategia que permite la multiplicación masiva de plantas, las cuales
ademas de ser geneticamente uniformes e identicas a la planta madre,
tienen la ventaja de ser plantas libres de patogenos.
En
el caso particular de Agave, Tapati (1992) observo la micropropagación
de Agave sisalana. Vargas y Garcia (1996) senalaron que para A. sisalana
los segmentos de hojas y las yemas axilares eran los tejidos mas
adecuados para la inducción de respuestas morfogeneticas in vitro.
Estos
autores establecieron que para obtener brotes a partir de las yemas
axilares deberian sembrarse los explantes en medio conteniendo las sales
MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementadas con BA (2 mg l-1) y ANA (0,1 mg l-1).
Mas
recientemente, Hazra et al. (2002) establecieron las condiciónes para
la regeneración in vitro de esta especie, a traves de organogenesis
indirecta partiendo de tejido foliar. Rodriguez-Garay et al. (1996)
obtuvieron embiogenesis somatica en Agave victoriareginae. Por su parte,
Enriquez del Valle et al. (2005) encontraron que el uso de acido indol
acetico y las sales del medio de Schenk e Hildebrandt (1972) estimularon
el crecimiento de los brotes de Agave angustifolia y la producción de
mayor numero de raices.
En
el caso de A. cocui Trelease, Mogollon et al. (2003) estudiaron el
efecto de dos reguladores de crecimiento en el enraizamiento in vitro de
cocuy. Yepez et al. (2001) establecieron una metodologia para la
propagación de cocuy a partir de organogenesis indirecta utilizando
segmentos de hojas. Todas estas metodologias implican la formación de un
callo, lo cual es fuente de variabilidad genetica (Skirvin et al.,
1994).
Este
trabajo se baso en la obtención de un protocolo para la regeneración de
Agave cocui Trelease, basado en el cultivo in vitro de meristemas
provenientes de yemas axilares, como estrategia para la obtención masiva
de plantas, que apoyen el desarrollo socioproductivo de las
comunidades.
MATERIALES Y METODOS
El
trabajo se realizo en la Unidad de Biotecnologia Vegetal del Centro
Naciónal de Investigaciónes Agropecuarias (INIA-CENIAP) en Maracay. Se
usaron yemas adventicias provenientes de bulbilos del escapo de plantas
de cocuy (A. cocui Trelease) procedentes de la zona de Guamuy en el
municipio Urdaneta del estado Lara, Venezuela. Las yemas axilares se
removieron y se desinfestaron inicialmente en etanol 70% durante 1 min, y
posteriormente en una solución de hipoclorito de sodio 2,5% i.a.,
durante 5 min.
El
exceso de desinfectante se removio, bajo condiciónes de flujo laminar
de aire esterilizado, con tres lavados sucesivos con agua destilada
esterilizada. A las yemas axilares se le eliminaron los primordios
foliares externos, hasta obtener un explante de aproximadamente 0,5mm,
consistiendo del domo meristematico y de 1 a 3 primordios foliares. Los
explantes se sembraron en tubos de ensayo de 25x150mm conteniendo 10 ml
de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con tiamina (1 mg l-1), acido nicotinico (1 mg l-1), piridoxina-HCl (1 mg l-1), mio-inositol (100 mg l-1), BA (0, 0,1 y 1 mg l-1), ANA (0, 0,1 y 1 mg l-1) sacarosa (30 g l-1) y agar (5g l-1).
Se
sembraron bajo un diseno completamente aleatorizado en un factorial
3x3. Cada tratamiento consto de 10 explantes. Los tubos se colocaron en
la oscuridad 131 por 7 d. Las yemas se colocaron posteriormente bajo luz
fluorescente (16,95 W.m-2) a 28 ± 2
ºC y un fotoperiodo de 16 h. Se midio el porcentaje de supervivencia,
la tasa de crecimiento, numero de brotes, numero de plantas completas.
Los tratamientos se realizaron por triplicado.
Las
plantas obtenidas se transplantaron a una mezcla 1:1:1 de suelo: arena:
aserrin de coco, en una camara humeda 100% HR. Las plantas regeneradas
fueron regadas interdiario alternando una solución conteniendo . de las
sales MS y agua esterilizada. Cada 2 d se fueron abriendo agujeros en la
camara humeda para la adaptación gradual de las plantas a las
condiciónes ambientales.
RESULTADOS Y DISCUSION
El
cultivo de yemas axilares permitio la supervivencia de 100% de los
explantes sembrados, lo cual indico que la estrategia de desinfección
empleada fue eficiente en prevenir la aparición de microorganismos
contaminantes. Sin embargo, solo 40% de los explantes se mantuvieron
verdes 4 semanas posteriores a la siembra, correspondientes,
principalmente, a los tratamientos con altas dosis de BA. Esta respuesta
posiblemente se deba a las altas concentraciónes de las citoquininas
(BA) las cuales se han senalado que incrementan el contenido de
clorofila a traves de la diferenciación de cloroplastos, y en
consecuencia la capacidad fotosintetica (Davies, 1995). Debe tomarse en
cuenta que el efecto beneficioso de las citocininas en el mantenimiento
de la coloración verde de los tejidos parece estar relaciónada con el
efecto del genotipo, ya que, Bairu et al. (2009) observaron un efecto
acelerador del ennegrecimiento de apices caulinares de Harpagophytum
procumbens al estar presente en el medio de cultivo cualquier
citocinina. Los mismos autores encontraron que la presencia de cualquier
auxina potenciaba el proceso de oscurecimiento de los explantes.
Los
explantes que no mantuvieron el color verde, se necrosaron en las
primeras dos semanas de cultivo in vitro. El lavado sucesivo de los
tejidos que comenzaron a presentar oscurecimientos, con soluciónes
antioxidantes (Acido citrico 500 mg l-1, Acido Ascorbico 1 g l-1, DTT 10 mM o DIECA 2 g l-1), no inhibio el proceso de oscurecimiento en aquellos tejidos que lo exhibieron.
La
respuesta in vitro favorable de las yemas apicales como fuente de
explante en Agave ya fue estudiado por Vargas y Garcia en 1996. Estos
autores tambien senalaron el efecto beneficioso del medio MS
suplementado con BA y ANA para la formación de brotes.
Al
analizar el efecto del medio de cultivo sobre el crecimiento de los
explantes de cocuy se obtuvo que los datos de distribuyeron normalmente
(Coeficiente de Shapirowilk 0,92). El analisis de la varianza revelo
diferencias estadisticamente significativas entre los tratamientos, con
un R2 = 0,93 y el coeficiente de variación de 30%. Un mes
posterior a la siembra in vitro, los meristemas sembrados en el
tratamiento con 1 mg l-1 de ambos reguladores de crecimiento mostraron el mayor crecimiento (ver Cuadro), siendo notorios a simple vista, con un desarrollo inicial de coloración verdosa (Figura 1).
CUADRO.
Crecimiento de explantes de yemas axilares de cocuy (A. cocui Trelease)
a los 21 dias de ser cultivados in vitro en medios con diferentes
combinaciónes de ANA y BA.
(*)
Letras iguales indican que no hay diferencias estadisticamente
significativas entre los tratamientos segun la prueba de media de Tukey (a=0,05).
FIGURA 1. Brote verdoso de cocuy regenerado in vitro tres semanas posteriores a la siembra en condiciónes in vitro
El
resto de los tratamientos mostraron un crecimiento mucho menor para el
mismo periodo de tiempo, por lo que se decidio continuar con los medios
MS suplementados con 1 mg l-1 de BA y 1 mg l-1
ANA. En el caso de A. cocui Trelease los resultados difieren de los
obtenidos por Vargas y Garcia para la formación de brotes en A.
sisalana, requiriendose en el caso de cocuy la mitad de la concentración de BA y 10
veces más auxina. Esto podría deberse a diferencias en el contenido
interno de reguladores de crecimiento entre ambas especies, lo cual,
además del factor gen ético, puede ser explicado por la procedencia de
los explantes. Se sabe que la condición fisiológica de los explantes es
fundamental para la respuesta que exhibirán in vitro, y el
contenido endógeno de hormonas está directamente influenciado tanto por
el estado fisiológico del tejido, como por las condiciónes de
crecimiento de las plantas.
Posteriormente, de cada yema sembrada se observó la aparición de brotes múltiples, 2-6 brotes por explante (Figura 2),
en el mismo medio de cultivo, 8 semanas posteriores a la siembra. Este
proceso se vio acelerado cuando la temperatura se elevó hasta 40°C.
Efectos similares de estimulación de la brotación al aumentar la
temperatura han sido señalados en Allium chinense (Xu el al., 2008). Gong el al. (2005) observaron un efecto estimuladorde la brotación en Arabidopsis regulado por Gluthatione-S-transferasas (GSTS, E.e. 2.5.1.18),
las cuales han estado relaciónadas con la tolerancia a diferentes
estreses, entre los que se encuentra el estrés por temperaturas altas.
FIGURA 2. Brotes múltiples de cocuy a partir de una yema axilar cultivada in vitro
Cada
uno de los brotes formados, se separó individualmente en el mismo medio
de cultivo, dando origen a brotes con 3 a 6 hojas con morfología
aparentemente normal (Figura 3). En
ninguno de los brotes se observó la formación de raíces al mantenerlos
en el mismo medio de cultivo, esto posiblemente relaciónado con altas
concentraciónes de citocininas, las cuales es posible que favorezcan la
formación de los brotes, pero inhiban la inducción de las raíces. Pérez el al. (2006) demostraron que la rizogénesis en brotes de Stylosanlhes spp., se obtuvo al eliminar las citocininas del medio de cultivo.
FIGURA 3. Brote de cocuy desarrollado in vitro provisto de 3 a 4 hojas de morfología normal
Resultados similares fueron encontrados por Torres y Mogollón (2000) en el enraizamiento de brotes de Cattleya regenerados in vitro. Laplaze el al. (2007) observaron
que las citocininas tuvieron una acción inhibitoria sobre las células
formadoras de raíces laterales en el periciclo, inhibiendo la formación
del gradiente de auxinas necesario para la inducción del primordio
radical, estableciendo las primeras bases para el entendimiento del
efecto inhibitorio de estas hormonas sobre la rizogénesis.
En algunos casos el transplante a medio fresco permitió el desarrollo de brotes nuevos (Figura 4), con un predominio de 2 brotes por explante, y ambos
brotes presentaron la morfología típica de una plántula de cocuy. La
estimulación de la brotación debe estar relaciónada a la presencia de
citocininas en dosis lo suficientemente elevadas para cambiar la
relación Auxina/citocinina a favor de las últimas, estimulando la
organogénesis. En sus trabajos, Guo el al. (2005) trabajaron la inducción de brotes en cotiledones y segmentos nodales de Brassica como resultado de la aplicación exógena de citocininas. De igual modo. Li el al. (2009) mostraron el efecto beneficioso de la Cinetina sobre la inducción de brotes en Sorghastrum nutants L. Nash. Subotic' el al. (2009) estudiaron similarmente un incremento en la inducción de brotes de Centaurium erythraea con
el uso de citocininas, adiciónalmente estos autores señalaron que las
citonininas del tipo urea (Thidiazurón,
N-(2-chloro-4-pyridyl)-NO-fenillurea (CPPU)) indujeron mayor formación
de brotes que las citocininas tipo Adenina (Benzil Adenina (BA),
Cinetina (ClN) y 2isopentenil adenina (2iP)).
FIGURA 4. Brote adventicio de cocuy formado posterior al transplante de brote inicial a medio fresco
Los
brotes al ser transplantados a medio sin reguladores de crecimiento,
emitieron raíces, las cuales se elongaron hasta 10 cm de longitud en el
mismo medio de cultivo (Figura 5). Los
resultados parecen indicar que al eliminar los reguladores de
crecimiento el balance auxina/citocinina, pareciese aumentar a favor de
las auxinas, lo cual tendería a la inducción de raíces, tal y como lo señalaron Skoog y Miller (1957). Estos
resultados concuerdan con lo establecido por George y Sherrington
(1984) quienes señalaron que las citocininas endógenas podían inhibir el
enraizamiento. Similarmentc, Seeni el al. (1992) observaron la inhibición del enraizamiento en la orquídea Renanthera imschootiana por efecto de las citocininas, del mismo modo que Bairu el al. (2009) presentaron la inducción de raíces de Harpagophytum procumbens al eliminar las citocininas del medio de cultivo, demostrando el efecto inhibitorio de estos reguladores sobre el enraizamiento.
FIGURA 5. Brote de cocuy enraizado en medio sin reguladores de desarrollo
En un intento por explicar el efecto inhibitorio de las citocininas, Nishimura el al. (2004)
señalaron que el efecto inhibitorio de las citocininas en los procesos
morfogenéticos estaría relaciónado con la acción de los genes Histidina
Kinasa (HK), quienes actuarían sobre las células meristemáticas o de
inducción de formación de órganos, impidiendo el proceso de
diferenciación celular. Similarmente, Guo y Hu
(2008) observaron que al incrementar la concentración de citocininas en
Arabidopsis, el proceso de formación de raíces se inhíbía. Sin embargo,
Aloni el al. (2006) establecieron que
una vez formado el primordio radical, posiblemente bajo el control de
auxinas y etileno, las citocininas sintetizadas en el apice radical
controlaban la dominancia de la raiz principal inhibiendo el crecimiento
de las raices laterales.
Se
obtuvieron 415 plantas en el primer ciclo de cultivo, 8 semanas
posteriores a la siembra in vitro, de las cuales 300 se transplantaron a
una mezcla 1:1:1 de arena:tierra:aserrin de coco y se adaptaron
gradualmente a las condiciónes de humedad y luminosidad. El porcentaje
de plantas adaptadas en esta fase fue de 60%, y las perdidas de los
explantes principalmente se debio a danos en el sistema radical, el cual
se desprendia con facilidad. Dos semanas posteriores al transplante al
suelo, las plantas se colocaron a crecer en condiciónes de umbraculo,
donde presentaron la morfologia tipica de las plantas de cocuy (Figura 6
a, b y c.). El porcentaje de supervivencia al trasladar las plantas ya
endurecidas a condiciónes de umbraculo fue del 100%, donde las plantas
exhibieron una morfologia normal.
FIGURA 6. (a)
Plantas de A. cocui Trelease regeneradas in vitro ya transplantadas a
suelo, (b) materiales creciendo en condiciónes de cámara de aclimatación
o endurecimiento y (c) materiales creciendo en condiciónes de
umbráculo.
CONCLUSIONES
-
La propagación de A. cocui Trelease a partir de yemas axilares es una
estrategia efectiva para la propagación masiva de esta especie. -
Permite la regeneración de plantas completas de apariencia normal, en un
lapso de 8 semanas. - Las yemas apicales deben cultivarse in vitro en
un medio MS suplementado con BA y ANA a 1 mg l-1 respectivamente. - Para
la inducción de las raices los brotes regenerados deberan transferirse a
un medio desprovisto de reguladores de crecimiento, donde se produciran
raices de apariencia normal. - La eficiencia del proceso de transplante
a suelo dependera en gran medida de la calidad del sistema radical.
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